Национальный Фармацевтический журнал

Авторы: Stefan Braun, Niels Banik, Jennifer J. Widera, Jan Gerit Brandenburg and Tobias Rosenkranz (Штефан Браун, Нильс Баник, Дженнифер Дж. Видера, Ян Герит Бранденбург и Тобиас Розенкранц)

ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ВЯЗКОСТИ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ БЕЛКОВ

ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ  ВЕЩЕСТВА  ДЛЯ СНИЖЕНИЯ  ВЯЗКОСТИ  ПРЕПАРАТОВ  НА ОСНОВЕ БЕЛКОВ

Вязкость растворов белков является одной из основных проблем при приготовлении белковых препаратов высокой концентрации для подкожных инъекций. При введении высоковязких белковых растворов требуется прикладывать значительное усилие к поршню шприца. Это может привести к заметным болевым ощущениям у пациента. Во многих случаях введение препарата
просто невозможно.1,2

Исследование зависимости вязкости растворов белков от концентрации позволяет выделить два участка кривой (см. рис.1). При очень низких концентрациях (менее 75 мг/мл) растворы белков редко обладают высокой вязкостью. При повышении концентрации до 100-200 мг/мл вязкость растворов некоторых белков возрастает и превышает предел, после которого введение невозможно (примерно 20-25 мПа•с). На этом участке кривой некоторые белки демонстрируют склонность к взаимодействию друг с другом, т. е. образованию не-устойчивых кластеров, что приводит к повышению вязкости. При концентрациях свыше 200 мг/мл расстояние между соседними молекулами белка сокращается, что приводит к появлению белок-белковых взаимодействий даже в системах, несклонных к таким взаимодействиям. Несмотря на то, что определённые добавки могут снижать вязкость белков, демонстрирующих оба типа взаимодействий, они более эффективны чаще всего при концентрации белка менее 200 мг/мл.3,4
Межмолекулярные взаимодействия белков имеют ту же природу, что и внутримолекулярные, которые стабилизируют их структуру.
Это значит, что добавки для снижения вязкости, влияющие на взаимодействия между молекулами, потенциально могут также дестабилизировать структуру белка. По этой причине крайне важно найти баланс между способностью добавки к снижению вязкости раствора и её склонностью к нарушению структуры белка. Для некоторых вспомогательных веществ влияние их концентрации на стабильность белка подробно описано в литературе. При введении в низкой концентрации добавки выступают в роли стабилизаторов. Однако поведение добавок меняется с увеличением концентрации, и зачастую они оказывают заметное влияние на стабильность белка. Таким образом, концентрация вспомогательного вещества является критически важным фактором, определяющим стабильность белка.
Использование сочетания аминокислоты и анионной добавки позволяет добиться более сбалансированного эффекта. Комбинирование вспомогательных веществ увеличивает их влияние на вязкость раствора и может даже привести к синергическому эффекту. Как следствие, становится возможным снижение концентрации каждой из добавок, что положительным образом сказывается на стабильности белка.
В данной статье представлена оценка снижения вязкости при использовании вспомогательных веществ и их комбинаций, а также описаны синергические эффекты, возникающие при использовании пар ингредиентов, и влияние добавок на вязкость раствора в зависимости от pH. Результаты исследования показывают, как зависит усилие инъекционного введения от вязкости раствора белка, и подтверждают пригодность системы для достижения оптимального равновесия между вязкостью раствора и стабильностью белка. Представленные исследования показали, что введение двух добавок в меньшей концентрации более благоприятно сказывается на балансе вязкости и стабильности белка, чем введение одной добавки в большей концентрации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В таблице 1 представлен перечень вспомогательных веществ, входящих в платформу снижения вязкости. Для удобства читателя далее по тексту будут использованы аббревиатуры, приведённые в таблице 1. Эталонное вспомогательное вещество (бенчмарк) обозначено аббревиатурой BM.
Применение каждой из добавок в большинстве случаев снижает вязкость раствора, но может негативно сказаться на стабильности белка.
Для снижения вязкости белковых препаратов часто используют одну добавку. На рисунке 2 показано изменение вязкости двух модельных белков, инфликсимаба и эволокумаба, при раздельном введении добавок, входящих в систему снижения вязкости. Концентрированный коммерческий препарат инфликсимаба характеризуется вязкостью ~40 мПа•с при концентрации 120 мг/мл (см. рисунок 2A). Введение каждой из добавок в концентрации 75 ммоль/л снижает вязкость на 10-80%. Похожие закономерности можно наблюдать при удвоении концентрации вспомогательного вещества (150 ммоль/л). Сравнение результатов, полученных при концентрации добавки 75 и 150 ммоль/л, показывает, что наибольшее относительное снижение вязкости при повышении концентрации демонстрируют вещества, не обладающие высокой эффективностью. Для добавок, способных вдвое снизить вязкость раствора инфликсимаба, не отмечено кратного усиления эффекта при повышении концентрации. Добавки BM и Orn при отдельном введении не способны заметно снизить вязкость раствора инфликсимаба. Однако далее мы покажем, что эти добавки обладают ценными свойствами при использовании в комбинации с другими.
На рисунке 2B представлены схожие закономерности: для большинства добавок повышение концентрации приводит к дополнительному снижению вязкости препарата эволокумаба (170 мг/мл).
Повышение концентрации Phe, напротив, приводит к увеличению вязкости раствора белка. Таким образом, при удвоении концентрации добавки для обоих модельных антител дополнительного снижения вязкости раствора не отмечено.
Баланс между снижением вязкости раствора и сохранением структуры белка является залогом успеха при разработке стабильных, высококонцентрированных белковых препаратов. Для оценки влияния повышенной концентрации добавок (125-150 ммоль/л) на стабильность белка был проведён эксперимент по ускоренному старению белков. На рисунке 3 показано содержание мономерных форм в препаратах инфликсимаба и эволокумаба после экспозиции при 40°C и 75% относительной влажности в течение 28 суток. Концентрации препаратов инфликсимаба и эволокумаба составляли 120 мг/ мл и 170 мг/мл, соответственно. Почти все аминокислоты не оказывают заметного влияния на стабильность белков. Исключением стал фенилаланин (Phe), который оказывает наибольшее влияние на вязкость раствора инфликсимаба. Наблюдаемая дестабилизация белка под воздействием Phe подчёркивает важность сохранения баланса между вязкостью и стабильностью препарата.
Как видно из рисунка 3, три анионных добавки оказывают заметное дестабилизирующее влияние на оба белка. При введении TMP можно наблюдать существенное снижение концентрации мономерной формы. Возможно, это обусловлено нестабильностью самого производного витамина при повышенной температуре. В общем случае, введение высокоэффективных добавок, снижающих вязкость препарата, в концентрации 125-150 ммоль/л может приводить к дестабилизации белка. Аминокислоты, напротив, обычно оказывают стабилизирующее действие на белки.
Таким образом, можно сделать вывод, что повышение концентрации вспомогательного вещества может дополнительно снизить вязкость препарата, однако в некоторых случаях это может также привести к дестабилизации белка. Более того, даже повышения концентрации добавок может быть недостаточно для снижения вязкости препарата до требуемого уровня.

ВЛИЯНИЕ PH ПРЕПАРАТА НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДОБАВКИ
Как уже было показано, снижение вязкости препарата при введении вспомогательных веществ может варьироваться в зависимости от выбора белка. На следующей стадии исследования важно было определить влияние условий приготовления препарата. На рисунке 4 представлены значения вязкости препаратов эволокумаба (170 мг/мл) с pH 5 (ацетатный буфер) и pH 7,2 (фосфатный буфер). Материалы, использованные при приготовлении базовых буферных растворов, перечислены в таблице 2.
Вязкость препаратов, приготовленных с использованием указанных буферов, значительно выше 20 мПа•с. При pH 5,0 она составляет 59 мПа•с, а при pH 7,2 - 72 мПа•с. Добавление хлорида натрия при pH 7,2 оказывает более сильное влияние, чем при pH 5, вероятно, из-за меньшего заряда молекулы белка при значении pH 7,2, близком к его изоэлектрической точке (7,6). Добавки, входящие в платформу снижения вязкости (см. таблицу 1), демонстрируют разные особенности поведения. Эффект Phe не зависел от показателя pH препарата. Эффект добавок BM, Orn, BSAcid, Pyr и TMP меняется при изменении pH. Расчёт характеристик молекул вспомогательных веществ при pH 4-8 проводили с применением методов вычислительной химии. Полученные значения использовали для оценки взаимосвязи снижения вязкости с изменением свойств белка или добавки. Исходные значения pKa веществ оказывают существенное влияние на эти свойства; их определяли методом титрования.
Результаты представлены в таблице 3.
Протонирование молекулы при снижении pH до 5 обнаружено только в случае TMP. Также в ходе работы оценивали изменения дипольного момента, доступной площади поверхности и коэффициента разделения вода/ноктанол, характеризующего гидрофобные свойства молекулы. Добавка TMP сильнее всего повлияла на вязкость раствора при обоих значениях pH. Поскольку для остальных вспомогательных веществ зависимости свойств от pH выявлено не было, различия в их способности к снижению вязкости препарата, скорее всего, обусловлены природой белка. Гидрофобные свойства эволокумаба не зависят от значения pH, что приводит к повышению заряда молекулы при снижении pH. Заряд молекулы, в свою очередь, влияет на интенсивность взаимодействия между белком и добавкой. Данный пример показывает, что для составления белкового препарата при разных условиях могут потребоваться разные вспомогательные вещества.
Следовательно, наличие набора таких добавок позволит специалистам, занимающимся разработкой рецептур, подбирать добавки в соответствии с характеристиками препарата.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОМБИНАЦИЙ ДОБАВОК ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ВЯЗКОСТИ БЕЛКОВЫХ ПРЕПАРАТОВ
Поскольку эффективности отдельных добавок может быть недостаточно для снижения вязкости концентрированных белковых препаратов, система снижения вязкости основана на применении сочетаний вспомогательных веществ. В них аминокислоту, т.е. BM, Orn или Phe, используют совместно с анионной добавкой. Возможность изменения комбинаций даёт специалистам по разработке рецептур широкое пространство для манёвра, позволяя добиться оптимального баланса между снижением вязкости и стабильностью белка и учесть другие особенности системы, например, способ введения, которые могут влиять на значение pH потенциального препарата.
На рисунке 5A показаны значения вязкости препарата инфликсимаба (120 мг/ мл) с разными комбинациями добавок. Серый столбец соответствует контрольному эксперименту, для которого немодифицированный коммерческий препарат довели до заданной концентрации белка. Полученное значение вязкости (~40 мПа•с) слишком велико и не позволяет использовать препарат для подкожных инъекций. Фиолетовый столбец соответствует эксперименту с эталонной добавкой (бенчмарком), введение которой приводит к незначительному снижению вязкости. В некоторых случаях сочетание Orn, BM или Phe с анионной добавкой приводит к более существенному снижению вязкости, в том числе и ниже порога введения, что представляется особенно важным. Для каждой аминокислоты существует множество комбинаций, которые позволяют добиться пригодности препарата инфликсимаба для инъекций. Добавка Orn особенно эффективна в сочетании с Pyr. Эталонное вспомогательное вещество (бенчмарк) можно использовать в комбинации с TMP. Добавка Phe лучше всего сочетается с BSAcid или TMP. Таким образом, для инфликсимаба было выявлено несколько различных эффективных комбинаций вспомогательных веществ. Как бы то ни было, некоторые вспомогательные вещества не пригодны для всех способов введения из-за риска развития тканеспецифичных реакций. Поэтому может быть полезно иметь под рукой универсальный набор добавок.
На рисунке 5B представлены результаты аналогичного эксперимента с использованием эволокумаба в качестве модели. В качестве контрольной пробы использовали состав с добавлением 150 ммоль/л хлорида натрия для отслеживания ионных эффектов. В отличие от инфликсимаба, коммерческие препараты эволокумаба содержат мало солей. Вязкость препарата эволокумаба можно довольно успешно регулировать с помощью эталонной добавки (бенчмарка). Однако в некоторых случаях (при выборе определённого пути введения или развитии местной реакции у пациента) применение эталонной добавки нежелательно. В представленной системе снижения вязкости присутствует ряд альтернативных добавок.
Для более полной демонстрации преимуществ применения комбинаций добавок мы исследовали их на предмет проявления синергических эффектов. На рисунке 6 измеренные значения вязкости систем, содержащих комбинации вспомогательных веществ, сопоставлены с ожидаемыми значениями вязкости, рассчитанными по результатам раздельного введения добавок. Точки, лежащие ниже прямой тождественного равенства, свидетельствуют о наличии синергического эффекта снижения вязкости у некоторых комбинаций добавок. Другие комбинации, несмотря на общее снижение вязкости, синергического эффекта не проявляют. С большой долей вероятности, поведение систем определяется свойствами исследуемого белка и препарата.
Таким образом, результаты исследования двух модельных антител демонстрируют возможность более эффективного снижения вязкости препаратов при использовании комбинированных добавок по сравнению с продуктом, принятым в качестве отраслевого стандарта.
Комбинации добавок демонстрируют также повышенную эффективность по сравнению с отдельными добавками, даже в больших концентрациях, и порой обладают синергическим действием. Более того, наличие набора добавок даёт специалисту по подбору рецептуры более широкое пространство для манёвра. Возможность выбора вариантов, в зависимости от природы антител, целевого pH или способа введения, может быть крайне полезным при разработке рецептур. Оптимальное сочетание вспомогательных веществ зависит от типа белка и характеристик препарата.

ВЛИЯНИЕ СНИЖЕНИЯ ВЯЗКОСТИ РАСТВОРОВ БЕЛКА НА ПРОЦЕСС ЗАБОРА ПРЕПАРАТА ШПРИЦЕМ
Чтобы подчеркнуть влияние вязкости и платформы снижения вязкости на процесс забора препарата, мы провели исследование, в котором измерили два взаимосвязанных фактора: время забора препарата и усилие нажатия на поршень шприца при введении. Сначала определили время забора концентрированных препаратов инфликсимаба (120 мг/мл) и эволокумаба (170 мг/мл) с введением самых высокоэффективных добавок и без них (рисунок 7A). Время забора препарата инфликси-маба шприцем объёмом 1 мл через иглу 27 типоразмера составило 75 с. Добавление пары Orn/TMP снизило время забора на 19%, а введение пары Phe/TMP - на 44%. Отбор концентрированного препарата эволокумаба аналогичным шприцем занял 116 с. Добавление пары Orn/ Pyr снизило время забора до 46 с, а введение пары BM/TMP - до 37 с.
На рисунке 7B представлены значения усилия нажатия поршня при введении препаратов инфликсимаба и эволокумаба шприцем объёмом 1 мл с иглой 27 типоразмера (BD Plastipak™, шприц объёмом 1 мл, игла 27G, 13 мм). Усилие нажатия поршня сильно зависит от типа и размера шприца, а также от длины и внутреннего диаметра иглы. В настоящем исследовании влияние системы снижения вязкости на усилие инъекции оценивали при скорости потока 0,2 мл/с. В литературе описаны примеры, когда скорость потока составляла 0,15 и 0,45 мл/с.7 Производитель эволокумаба поставляет его в шприц-ручках для самостоятельного введения со скоростью потока 0,2 мл/с. Поэтому в качестве модельного значения была принята скорость потока 0,2 мл/с. Для коммерческого препарата инфликсимаба (120 мг/мл) усилие нажатия на поршень составляет примерно 20 Н. Специальные добавки могут снизить усилие до ~15 Н. Для препарата эволокумаба (170 мг/мл) эффект выражен ещё сильнее.
Для препаратов в стандартном буфере усилие нажатия на поршень составляет 30 Н. Обе комбинации добавок позволяют снизить усилие нажатия поршня примерно на 50%. Представленные примеры ярко демонстрируют улучшение характеристик процесса забора препарата шприцем при снижении вязкости концентрированных белковых препаратов.

ВЛИЯНИЕ СИСТЕМЫ СНИЖЕНИЯ ВЯЗКОСТИ НА СТАБИЛЬНОСТЬ БЕЛКА
Как уже было сказано ранее, равновесие между вязкостью раствора и стабильностью белка довольно хрупко.
Для оценки стабильности белков мы провели эксперимент по ускоренному старению препаратов, содержащих комбинированные добавки в различных концентрациях. Как показано на рисунке 8, применение комбинации вспомогательных веществ оказывает более существенный эффект, нежели применение только анионной добавки. В эксперименте использовали препараты с добавлением вспомогательных веществ без дополнительной оптимизации. Стабильность модельных белков оценивали после длительного хранения при 2-8°C и 25°C/60% отн.вл.
Рисунок 9A показывает, что после экспозиции в течение 24 недель при 2-8 °C для всех выбранных комбинаций добавок в препаратах инфликсимаба и эволокумаба сохраняется высокое содержание мономерных форм. Поскольку столь высокой стабильности белка удалось добиться даже без оптимизации состава, можно ожидать её дальнейшего повышения при проведении полной разработки рецептуры. Стоит особо отметить, что использование комбинации Phe/TMP позволяет сохранить высокую концентрацию мономерных форм при 2-8 °C.
При температуре 25 °C введение TMP оказывает сильный дестабилизирующий эффект и приводит к полному израсходованию мономерной формы. Данный факт подтверждает гипотезу о снижении стабильности белка из-за разложения добавки. После экспозиции составов, содержащих выбранные комбинации добавок, в условиях ускоренного старения (25°C/60% отн.вл.) в пробах наблюдается высокое содержание мономерной формы (в некоторых случаях свыше 95%). Таким образом, было показано, что использование комбинаций вспомогательных веществ для снижения вязкости может оказывать положительное влияние на стабильность препаратов при хранении.
ВЫВОД
Платформа снижения вязкости представляет собой линейку вспомогательных веществ, а принцип её использования заключается во введении в препарат аминокислоты и вспомогательной добавки для снижения вязкости. Вспомогательные добавки зачастую оказывают сильное влияние на стабильность белка при индивидуальном введении, однако использование аминокислот позволяет компенсировать этот негативный эффект и усиливает их влияние на вязкость раствора. Платформа снижения вязкости обеспечивает улучшенный контроль над стабильностью и вязкостью белковых препаратов. Как следствие, применение данной платформы облегчает под-кожное введение препаратов и повышает их стабильность. Также применение платформы позволяет повысить удобство и экономичность введения препаратов с использованием специальных устройств. Платформа снижения вязкости даёт технологам широкий выбор вариантов для разработки рецептур с учётом способа введения и особенностей выбранного белка.
Для получения подробного руководства пользователя системы снижения вязкости посетите сайт: sigmaaldrich.com/viscosity-reduction. Для получения тестового набора и информации о коммерческом лицензировании обратитесь к локальному торговому представителю.

ССЫЛКИ
1. Viola, M. et al. Subcutaneous delivery of monoclonal antibodies: How do we get there? (Подкожное введение моноклональных антител: Как добраться до цели?) Journal of Controlled Release 286, 301-314, 2018. doi:10.1016/j. jconrel.2018.08.001
2. Shire, S. J., Shahrokh, Z. & Liu, J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. (Сложности при разработке концентрированных белковых препаратов.) Journal of pharmaceutical sciences 93, 1390-1402, 2004. doi:10.1002/jps.20079
3. Xu, A. Y., Castellanos, M. M., Mattison, K., Krueger, S. & Curtis, J. E. Studying Excipient Modulated Physical Stability and Viscosity of Monoclonal Antibody Formulations Using Small-Angle Scattering. (Изучение физической стабильности и вязкости препаратов моноклональных антител со специальными добавками методом малоуглового светорассеяния.) Molecular pharmaceutics 16, 4319-4338, 2019. doi:10.1021/acs. molpharmaceut.9b00687
4. Yadav, S., Shire, S. J. & Kalonia, D. S. Viscosity behavior of high- concentration monoclonal antibody solutions: correlation with interaction parameter and electroviscous effects. (Характеристики вязкости концентрированных растворов антител: корреляция между параметрами взаимодействия и электровязкостными эффектами.) Journal of pharmaceutical sciences 101, 998-1011, 2012. doi:10.1002/jps.22831 (2012)
5. Platts, L., Falconer, R. J. Controlling protein stability: M e c h a n i s m s r e v e a l e d u s i n g formulations of arginine, glycine and guanidinium HCl with three globular proteins (Контроль стабильности белков: Механизмы, выявленные для препаратов трёх глобулярных белков, содержащих аргинин, глицин и гуанидина гидрохлорид), International Journal of Pharmaceutics, Volume 486, Issues 1-2, 131-135, 2015. doi:10.1016/j. ijpharm.2015.03.051
6. Schnellbaecher, A., Binder, D., Bellemaine, S., Zimmer, A. Vitamins in cell culture media: Stability and stabilization strategies (Витамины в культуральных средах: Стабильность и стратегии стабилизации), Biotechnology and Bioengineering, 116:1537-1555, 2019. doi:10.1002/ bit.26942
7. Usach, I., Martinez, R., Festini, T., Peris, E. Subcutaneous Injection of Drugs: Literature Review of Factors Influencing Pain Sensation at the Injection Site (Подкожное введение лекарственных препаратов: Обзор факторов, влияющих на болевые ощущения в области инъекции); Adv Ther., 36:2986-2996, 2019. doi. org/10.1007/s12325-019-01101-6
8. Mendrinos, E., Petropoulos, I. K., Mangioris, G., Papadopoulou, D. N., Pournaras, C. J. (Интравитреальная инъекция L-аргинина обращает развитие сокращения артериол сетчатки после экспериментальной острой окклюзии ветки вены сетчатки), Experimental Eye Research, 91:205e210, 2010. doi:10.1016/j. exer.2010.05.002
9. Pracht P., Bohle F., Grimme, S. Automated exploration of the low- energy chemical space with fast quantum chemical methods (Автоматизированное исследование пространства низкоэнергетических химических веществ с применением быстрых квантовохимических методик); Phys. Chem. Chem. Phys., 22, 7169-7192, 2020. doi.org/10.1039/C9CP06869D
10. Bannwarth, C., Caldeweyher, E., Ehlert, S., Hansen, A., Pracht, P., Seibert, J., Spicher, S., Grimme, S. Extended tight-binding quantum chemistry methods (Расширенные методы квантово-химического исследования в приближении сильной связи); WIREs Comput Mol Sci., 11:e1493, 2021. doi. org/10.1002/wcms.1493
1 1 . B r a n d e n b u r g , J . G . , B a n n w a r t h , C . , H a n s e n , A . , Grimme, S. B97-3c: A revised low-cost variant of the B97-D density functional method (B97-3c: Дополненный, экономичный вариант метода функционала плотности B97-D), J. Chem. Phys., 148, 064104, 2018. doi.org/10.1063/1.5012601
12. Klamt, A. Conductor-like Screening Model for Real Solvents: A New Approach to the Quantitative Calculation of Solvation Phenomena (Проводниковая модель скрининга истинных растворителей: Новый подход к количественной оценке сольватации); J. Phys. Chem., 99, 7, 2224-2235, 1995. doi. org/10.1021/j100007a062

СКАЧАТЬ СТАТЬЮ PDF

Задайте вопрос представителю компании:

Направить вопрос эксперту могут только зарегистрированные пользователи

Направить вопрос эксперту могут только зарегистрированные пользователи